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解释生殖实验室是如何作的

2018-8-2 11:01| 发布者: admin| 查看: 1457| 评论: 0

摘要: 生殖实验室为了在其活动范围内开展工作,需要具备以下几点:(1)程序如何实施的书面介绍,(2)实施程序和常规的人员;(3)程序实施所需要的资源与设施。 实验室手册 制定实验室程序手册,以标准的方式定义工作的 ...


生殖实验室为了在其活动范围内开展工作,需要具备以下几点:(1)程序如何实施的书面介绍,(2)实施程序和常规的人员;(3)程序实施所需要的资源与设施。  

实验室手册  

制定实验室程序手册,以标准的方式定义工作的所有方面。理论上来讲,生殖实验室(reproductive laboratory,RL)实施的大多数程序都相当标准化。设计这些程序用来诊断或治疗一对夫妇的生育潜能状况的损害。 然而,在每天的实践中,不同的实验室甚至同一设备的不同操作者都会在程序中出现很大的变异 。因此,已经报道的数据的准确性和可靠性也打了折扣,想要在实验室内部或多个实验室之间比较数据也是非常困难的。进一步说,由于缺乏标准化,使得实施以证据为基础的问题解决办法非常困难。例如,如果没有系统地对培养箱温度、 浓度以及培养液pH的每日报告,就不可判定突发的受精率骤降是由于培养环境变化还是其他条件变化的影响。同样地,如果缺乏对所使用的塑料器皿的质量控制,就很难判断在精子处理之后出现的精子活力的下降是由于所使用的新容器中塑料的毒性还是其他的因素造成的。   

生殖实验室的程序手册应该从建立完整的标准操作程序(Standard Operating Prcedures,SOPs)开始。每一次参与患者检测和样品处理的每一位人员都要遵守这些SOPs。SOPs相关的详细阐述,客观并具有可重复性,在质量控制中发挥重要的作用。实验室人员随时可以获得程序手册。SOP的最低要求包括分析前和分析后相关的工作,同时也包括应该代表实验室工作路径的分析活动。一个有效的SOP包括测试可重复性和有效实施的所有必要信息。

尽管SOPs的详细阐述需要遵循国内或者国际专门机构已经建立的模式和标准,然而,特殊的风格和格式可以由实验室主任谨慎决定[2]。模板可以从很多地方获得,如“临床和实验室标准协会”(http:// www.clsi.org),并且可以作为创建实验室专门的程序手册的起点。图9.1和图9.2提供了简化后的生殖实验室标准操作程序的实例。  

生殖实验室除了要建立关于测试/检查/处理体液、细胞及组织的SOPs ,还要创建一个技术手册,包括对工作活动范围内处理的所有样本如何识别、转移、存储以及报告结果的详细信息。

典型的生殖实验室技术手册的内容 

1.介绍                       

精子在精浆中过长时间的暴露会显著降低运动能力和存活能力。相反,脱离精浆后在合成的培养液中精子指标不会降低。因此,临床需要的精子,如体外受精(IVF)/卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI),在精液射出后尽快分离精子是十分必要的。  

2.程序的原则  

在ART精子处理中胶体密度梯度离心是一种常用的方法。密度梯度离心在从精液中选择出高活力的精子同时,梯度的中间相可以去除白细胞和其他微生物。  

3.样品收集  

精液样本通过手淫获得。参考SOP的样本收集部分作为具体指导。  

4.设备与材料  

一次性无菌血清学吸管(1、2、5、10ml)  

一次性聚苯乙烯圆底无菌带盖离心管  

一次性无菌移液管  

   1~200μl移液器和无菌枪头  

移液装置  

6ml带盖聚苯乙烯无菌离心管  

计数板  

   细尖的记号笔  

   层流净化台  

37℃培养箱  

   离心机  

5.试剂  

HEPES缓冲洗精培养液  

人血清白蛋白(HSA)  

胶体密度梯度液(与亲水盐类共价结合并添加HEPES二氧化硅颗粒胶体悬浮液),下层相和上层相  

6.质量控制  

新批号的一次性接触性耗材或者试剂需要通过精子存活试验来检测其毒性。只有商业生产的并且已经被国家相关管理机构批准的试剂的才能够使用。这项程序中所有使用的试剂的分析证明文件包括pH、渗透压、无菌保证级别、细菌内毒素级别和小鼠胚胎生物检测结果等。试剂需要保存在4~8℃ 冰箱中并且在到达保质期1周之前用完。在每个程序中都需要记录所用试剂的批号。  

7.程序描述  

准备试剂:  
 (1)将所有梯度离心试剂盒的组分(包括上层相和下层相)以及精液样本放在37℃ 培养箱中 20分钟。  

(2)将1ml(梯度的体积也许会变小)下层胶体梯度液转移至一个一次性无菌锥底离心管中。  

(3)用移液管将1ml上层相铺在下层相的上面。  

通过抬高移液管使上层相慢慢地展开并慢慢地升高液面。可以现察到明显的两个相的分界线。这个两层相的梯度最多稳定保持2个小时。  

(4)在15ml离心管上标记患者的名字。  

分析并洗涤样本:  

注意:整个样本的操作过程都需要无菌。精子的处理过程需要在无菌层流柜中进行(例如Ⅱ级生物安全柜)  

(1)在处理之前,精液样本需要在37℃ 培养箱中放置15~30分钟使其完全液化。  

(2)用一个无菌管来测量样本的体积。  

(3)取一滴样本,评估精子密度、活力和圆细胞数。  

(4) 轻轻地将最多2ml精液样本转移至上层相的上面。如果样本的体积大于2ml,需要在处理之前将精液样本分成2份。  

(5)300g离心20分钟。  

(6) 用一个无菌移液管将上层悬液弃掉,直至下层相水平以下。  

(7)用无菌移液器在沉淀中加入1.5~2ml添加HAS的HEPES缓冲的精液洗涤培养液,用吸管轻轻混匀,直到精子沉淀物在悬浮液中。  

(8)300g离心7分钟。  

(9)用一个无菌移液管将沉淀上面的悬浮液全部吸走。  

(10)用一个1ml无菌移液器向沉淀中加入0.5ml精液洗涤培养液并重悬。记录最后的体积,用常规洗涤后精液分析方法分析精子的密度和活力。  

8.危急值  

进行洗涤前分析。在处理样本时,要特别关注外来的可能存在的圆细胞、碎片和细菌。如果圆细胞的密度大于100万/ml,立即进行Endtz检测。如果检测结果阳性需立即报告实验室主任。  

9.分析操作注意事项  

缓冲培养液(HEPES或类似的培养液)是 在37℃ 空气培养箱中使用的,此时试管的盖子需要拧紧。当培养箱的C02浓度是5%(v/v)时,培养液需要用碳酸氢钠平衡液或类似的平衡液进行平衡,此时试管的盖子需要拧松以保持气体交换。坚持这些原则可以使培养环境的pH适合精子的存活。   
 
简化后的密度梯度离心处理精液的标准操作程序实例   

1.介绍  

对于无精子症患者行卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)所需的精子,目前有几种附睾和睾丸获取精子的方法。睾丸精子抽吸术(TESA)适用于附睾穿刺术(PESA)失败后的梗阻性无精子症(OA)患者和非梗阻性无精子症(NOA)患者。非梗阻性无精子症还可以使用睾丸切开术(TESE),即在睾丸上进行单个或多个开放性切口活检的手术,但最近非梗阻性无精子症(NOA)患者更倾向于进行显微手术(micro-TESE)。  

2.操作原则  

手术获得的精子的处理方法与一般的精液精子的处理方法不同 。精子处理方法不仅要便于筛选出最佳质量的精子用于ICSI,同时还要优化精子的受精能力。为了实现这些目标,实验室人员应做到:  

(1)尽可能取得最佳质量的手术获取的样本,不含或仅含有最少的污染物,如红细胞和有害微生物;  

(2) 在精子处理过程中,通过掌握技术技能和控制多个影响因素将医源性细胞损伤最小化;影响因素包括离心力及离心时间、紫外线暴露和温度波动、实验室空气质量条件、稀释和清洗精子的步骤、试剂、培养液及一次性耗材的质量等;  

(3)提高精子受精潜能,如果可能,当只有不活动精子时,使用精子激活剂或选择能存活的精子行ICSI。  

3.样本收集  

由手术医生通过经皮穿刺抽吸或者切开活检收集睾丸样本。请参考精子获取操作的SOPs,以获得更多的信息  

4.设备及材料  

50mm×9mm和60mm×15mm培养皿(无菌)  

一次性血清学吸管(5.0ml)  

微量移液枪(1~200μl)及无菌枪头  

自动移液设备  

    6ml带盖无菌聚苯乙烯离心管  

    0.7mm×25mm针头(26号)和无菌结核菌素注射器  

细尖记号笔  

微量注射针  

层流净化台  

热台  

体视镜  

离心机  

配备有霍夫曼相差模块和电动液压微幅操作臂的倒置显微镜。  

5.试剂  

含HEPES的精子清洗缓冲液  

矿物油  

PVP 溶液  

人血清白蛋白  

6.质量控制  

新批号的一次性接触性耗料或者试剂需要通过精子活力生物试验来检测其毒性。只有商业生产的并且已经被国家相关管理机构批准的试剂才能够使用的这项程序中所有使用的试剂的分析证明文件包括PH、渗透压、无菌保证级别、细菌内毒素级别和小鼠胚胎生物检测结果等都需要提供。试剂需要保存在4~8℃ 冰箱中并且在保质期前1周之前用完。在每个程序中都需要记录所用试剂的批号。  
 7.程序描述  

实验室准备:  

注意:实验全程应在层流洁净台或洁净房中进行无菌操作。  

(1)准备20ml添加蛋白(5% HSA)的HEPES精子处理缓冲液,保存于37℃。  

(2)将5ml含蛋白的精子处理液加入6ml聚苯乙烯管中,将其送至手术间(精子处理液用于在手术前冲洗精子抽吸进系统和培养收集到的睾丸组织)。  

(3)准备4个皮氏2孔皿,分别向内外孔加0.5ml和1ml精子处理液。将其中2个另外2个放在工作台的37℃ 热台上,另外2个送至手术室备用。  

(4) 准备2支配有 26 号针头的结核菌素注射器(用于撕碎和挤压精曲小管)。  

操作程序:  

(1)将睾丸小块实质组织放入2孔皿的外孔中,在体视镜下用带针头的结核曲素注射器识别精曲小管,并移走血块。  

(2)将精曲小管放入含新鲜精子培养液的2孔皿的内孔中。用两支注射器将精曲小管反复撕开切碎(一支用来按压住精曲小管,另一支用来对其撕扯和挤压)。重复该操作直至看不到完整的精曲小管。  

(3)将睾丸均匀混合组织置于放大400倍的倒置显微镜下观察,一旦发现足够ICSI用量的精子立即通知手术医生。整个过程不得超过10分钟,因为患者仍处于麻醉状态,等待医生决定是否继续或结束手术。如果还需要更多的标本,请重复以上步骤。  

(4)将内孔中的细胞悬液吸到一支无菌离心管中。加入3ml新鲜精子培养液以300g离心7分钟。弃上清,用0.2ml新鲜精子处理液重悬沉淀。如果处理后的样本中仍含有大量的红细胞,就有必要用红细胞裂解液对其进行稀释并重新离心(详见用红细胞裂解液处理手术采集的样本的相关SOP)。  

(5) 准备一个多个微滴并覆盖矿物油的皮氏培养皿,用于从处理后的睾丸细胞悬液中挑选精子(见从处理后的睾丸细胞悬液中挑选精子的SOP)。  

(6) 向每个10μl的外围精子培养液微滴中加入1 ~4μl精子悬液。显微注射针中先吸一小段PVP,以便在吸取精子时更好地控制,同时避免向PVP微滴吹出选择的精子时产生气泡。用显微注射针将细胞悬液中的精子转移到PVP微滴中。  

(7)在处理后的样本中挑选完精子后,在PVP微滴中去除显微注射针上沾带的任何细胞碎片。  

(8)将前面为ICSI预选的精子在放大800倍的显微镜下再进行最后的精子形态学评估。实施 ICSI参照现行SOP。对于ICSI后剩余的睾丸吸取组织可考虑冷冻保存。  

8.危急值  

如果在处理后的睾丸组织悬液里仅有不活动精子或未发现精子,要立刻向实验室主任报告。如果处理后仅见到不活动精子,应使用不同方法来区分活的不动精子和死精子,从而辅助挑选有活力的精子用于ICSI(见“选择有活力的精子用于ICSI的SOP”)。  

9.实验效果的优化  

为了提高睾丸精子的活力,可以将盛有睾丸组织悬液的微滴培养皿至于室温下培养48小时。这种情况下,微滴培养液使用HEPES或类似的缓冲液来配制。  
 
手术获得的睾丸精子处理过程的标准操作程   

编码                          名称  
 
 BCTG-MTO-01                        供者选择标准  

 BCTG-MTO-02                        样本采集  

 BCTG-MTO-03                        样本的运输和分配  

BCTG-MTO-04                        样本的处理  

BCTG-MTO-05                        标本的保存  
BCTG-MTO-06                        样本的释放  
BCTG-MTO-07                        样本的丢弃  
BCTG-MTO-08                        样本登记和可追溯性  
BCTG-MTO-09                        员工资质和职责  
BCTG-MTO-10                        不符合项及其追踪处理  
BCTG-MTO-11                        生物安全规范  
BCTG-MTO-12                        文档记录和控制  
BCTG-MTO-13                        现有的技术和操作程序手册  
BCTG-MTO-14                        数据收集和存储系统  
BCTG-MTO-15                        生物废物管理计划  
BCTG-MTO-16          &nbsnbsp;             可发育的组织和细胞库性能  
BCTG-MTO-17                        预防措施记录  
CRIO-MTO-01                        低温生物实验室描述  
CRIO-MTO-02                        低温生物实验室操作规程  
CRIO-MTO-03                        低温生物技术安全规范  
CRIO-MTO-04                        低温生物技术实验室质量控制指南  
CRIO-MTO-05                        标本冷冻保存  
CRIO-MTO-06                        液氮容器事故处理  
ANDRO-MTO-01                       男科学实验室描述  
ANDRO-MTO-02                       男科学实验室操作规程  
ANDRO-MTO-03                       精液样本采集、鉴别和标记  
ANDRO-MTO-04                       男科学实验室测试规范  
ANDRO-MTO-05                       男科学实验室生物安全规范  
ANDRO-MTO-06                       男科学实验室质量控制指南  
ANDRO-MTO-07                       男科学实验室器皿的洗涤程序  
ANDRO-MTO-08                       洗涤剂残留检测程序  
ANDRO-MTO-09                       塑料器皿用具精子存活率的测试程序  
ANDRO-MTO-10                       生物有害物质事故的处理程序  
ANDRO-MTO-11                       男科学实验室常规和清单  
FIV-MTO-01                         胚胎学实验室描迀��an lang="EN-US">  
FIV-MTO-02                         胚胎学实验室特性和标准化  
FIV-MTO-03                         胚胎学实验室质量控制指南  
FIV-MTO-04                         胚胎学实验室常规和淸单  
FIV-MTO-05                         C02培养箱的Fyrite气体分析仪  
FIV-MTO-06                         C02培养箱的电子巴哈拉赫分析仪  
FIV-MTO-07                         培养液的质量控制和pH值测定  
FIV-MTO-08                         培养箱的清洁和消毒程序  
FIV-MTO-09                         培养箱水托盘和支架更换程序  
FIV-MTO-10                         热板的质量控制  
FIV-MTO-11                         胚胎学实验室微生物控制  
FIV-MTO-12                         胚胎学实验室生物有害物质事故处理程序  
FIV-MTO-13                         胚胎学实验室的维护和淸洁  
FIV-MTO-14                         胚胎学实验室质量改进方案  
  


人员  

除了技术和 SOP 手册,生殖实验室应当有适当的人员履行其职责。监管机构和(或)专业组织应根据实验室人员配置建立应遵循的最低标准。对于没有制定相关监 管程序的国家,可采用其他已建立的模式,如美国病理学家协会生殖实验室认证项目所推荐的要求。  

总的来说,生殖实验室应有足够的人员可使他们在能力范围内按时完成工作,并具备可提供后备人员的相位机制。生殖实验室(RL)中实施的绝大多数测试/操作程序属于高度复杂的范畴,包括故障排除、解释、判断等,需要髙级的知识和技能。根据美国生殖医学学会(ASRM)建议的指南,至少需要2名有资质的工作人员才能完成所有的技术服务。然而,人员的数量和人员水平应根据实验室规模和复杂性而定。对于男科学实验室,不同国家人员需求因实验室所属不同联邦、州或地方的法规的标准不同而不同。例如,在美国,高复杂度的男科诊断检测如人工评估精子密度和形态采用CLIA管理标准。该标准要求男科学实验室有5个不同层次的人员:实验室主任、临床顾问、技术督导、普通事务督导和测试人员。如果资质允许,一个人可以拥有一个以上的职位。  

在大多数具有ART规范的国家,通常要求主任、督导和技术员这三个职位人员的资质和职责。实验室主任的要求在不同国家和地区会有所不同。有些地区要求主任必须具有医师资格,而有些地区要求有医师资格或者具有资质的某些学科的科学家,如生物化学、生物学和生殖生理学。实验室主任还应具有实验设计、统计学经验和解决问题的经验。实验室主任也应准备行使所提供服务的专业、组织、管理、咨询、科学和教学等多项职责,同时也负责维持质量标准、记录监管机构要求的遵从和实施情况。实验室督导和技术人员应具有相应的教育资历和经验,实验室根据规模和服务项目配置相应数量的人员。实验室督导的职责包括工作的日常监督和RL的监管。技术人员应该能够实施所有的常规技术并报告结果。美国生殖医学学会(ASRM)执行委员会建议,在胚胎学实验室最少应有2名工作人员完成过超过150例体外受精(IVF)周期。然而, 在IVF周期数量更多并同时承担男科学职责的实验室应配备更多的工作人员。在我们的方案中,每年每名IVF和男科学技术人员能够分别完成200个IVF(新鲜和冷冻保存) 周期和800个男科学程序(精液分析、精子功能测试、ART相关程序的精子处理和冷冻保存)的工作。  

对中等或以上规模生殖实验室,其他不同水平的人员,如技术人员、护士、医疗助理、管理和辅助人员,也是很关键的。在我们的方案中,受过辅助生殖技术专门培训的注册护士和医疗助理负责:(1)对接受ART相关程序的夫妇提供护理服务,如取卵、手术获取精子和胚胎移植;(2)医生实施卵母细胞/精子收集和胚胎移植时给予技术协助,(3)为不孕夫妇提供教育、咨询和支持。  

尽管在大多数实验室,实验室主任履行质量管理职责,理想的情况是,一名专职的质量经理负责实验室的质量管理。质量经理确保实验室主任和其他人员完全履行几项任务中的职责,也促进实验室内工作的所有员工间有效的合作。质量经理负责监督和评估向患者提供的服务的方案。质量经理与实验室督导和技术人员紧密配合,及时发现问题并找到解决方案,以确保实验室服务质量(质量保证)符合其质量特点。这样整合的团队工作可以逐步改进患者服务和内部生产相关工作的质量和效率(质量改进)。图9.3描述了生殖实验室职责和完成特殊任务的人员要求。  

结构和资源

生殖实验室成该具有足够的空间,提供安全和舒适的工作条件,并根据实施测试/程序的容量和范围进行设计。为实施所提供的服务实验室必须拥有或可以使用所有必要的设备。本章由于篇幅有限,不能详细描述建立生殖实验室的技术要求和基础设施。下面提供了有关生殖实验室的设计、资源和安全性的基本要求的相关信息。

专业学会和(或)监管机构实验基础设施、设备和供应的最低标准已发表了,也可以在其他文献中找到。不同地区有不同的标准,有些国家的监管机构强制要求符合这些标准,例如欧盟和巴西。

在理想的情况下,生殖实验室应该坐落于交通便利、车流量低且安全的区域。一个高质量的实验室必须遵守当地的法规,实验室的设计、空气质量控制、照明、安全以及技术资源应当与之相适应。有关研究结果推荐实验室所有治疗性操作都使用无毒的一次性材料。化学品和试剂必须正确标注和保存。胚胎学实验室内不允许使用有毒的化学品或放射性同位素。所有的实验室员工可以随时获得有关实验室技术、维护、方针手册以及参考材料。胚胎学实验室应尽可能实现无纸化以避免污染。可以通过使用电子手册、文档、表格以及电脑数码摄像等工具完成内部沟通。然而,当电子文档无法访问时(例如:实验信息系统或网络故障),实验室人员必须有相应的程序支持完成工作,例如,实验室必须保持容易获得的纸质或是电子版本的备份。生殖实验室可分出一间单独的办公室承担管理功能。

男科学实验室

男科学实验室虽然可与其他实验室相邻,但它应该有自己独立的空间进行各种以诊断和治疗为目的的操作。治疗性操作,比如精液处理和精液冷冻保存,应当在无菌环境下进行无菌操作。成本效益最佳的男科治疗性程序的实施应使用生物安全柜,因为它能在三个层面提供保护:(1)保护工作人员不会受到安全柜内有害物质的伤害;(2)保护标本在处理过程中不会受到污染;(3)保护环境不会受到安全柜内物质的污染。生物安全柜按照生物安全水平分类。由于生殖细胞/组织对人员和周围的低污染风险而且无有害蒸汽和气体,Ⅱ级A型生物安全柜是合适的。一个Ⅱ级A型生物安全柜常见特点包括:(1)前方入口开放,保持内向气流;(2)工作区域内高效、特殊的HEPA过滤设施、垂直的和单向的气流;(3)HEPA过滤设施排放空气进入室内或进入设备排气系统。一个内置的风扇将室内空气通过前方的开口吸入柜内,到达前端进气格栅。供应的空气随后通过HEPA过滤器再向下流至工作台面。因为气流向下,在工作台面有6?18cm的落差,一半向下流的空气进入前面的排放栅,另一半通过后方的排气栅。工作台面产生的任何漂浮颗粒立即被向下的气流捕获,并通过前或后排气栅排出,从而为产品和人员提供最高水平的保护。排放的气体随后通过后增压的方式排放到位于安全柜顶部的供应和排放过滤器之间的空间里。限于这些过滤器的相对大小,大约70%的气体通过供应HEPA过滤器重新循环回工作区;而剩余30%的气体则通过排放过滤器经过滤后排放到室内或户外。男科学实验室进行治疗性操作时使用的生物安全,管理机构有可能会要求周围空气质量控制。比如在巴西,所有实施以治疗为目的的精子处理的男科学实验室应该具备正压空气粗颗粒过滤。

实验室实施的检测/程序类型和数量决定物理区域的规划,也决定所需要的技术人员及设备的数量。对于新建的实验室来说,谨记如果有现成的空间,扩大规模更加容易。这一点非常重要。因此,虽然小的空间也可以根据布局优化利用空间,但是预留未使用的空间会有助于实验室未来的扩展。

取精室是生殖实验室不可缺少的一部分,必须位于一个安静而私密的地方,并且紧邻男科学实验室。室内应配备合适的家具及洗手池以便患者在取精前后都可以洗手。理想状态下,取精室最好配备小便池而不是坐便器。患者取精前应排空膀胱而不是肠道,以防止污染精液标本。室内应提供精液收集相关的指导、杂志和(或)视频。室内可以安装对讲系统的一个简单电子铃,当患者完成取精后通知护士或技术人员。

出于操作的目的,工作站应根据所开展的实验及程序进行设置。比如,用于常规精液分析的工作站应配置相差光学显微镜、血细胞计数板、热台及必要的试剂。

另外可以装备专用工作台进行精子染色、精子形态学评估及抗精子抗体检测。同一个生物安全柜可用于精液处理和精子冷冻保存程序。如果需要使用荧光显微镜,则需要一个暗室。



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